La paroi et la coloration de Gram

Si tu ne devais retenir qu'une seule technique de ce module, ce serait celle-ci. Hans Christian Gram, un médecin danois qui travaillait à Berlin, la publie en 1884, en cherchant à mieux voir les bactéries dans des tissus. Plus d'un siècle plus tard, c'est encore le premier geste devant une colonie inconnue, de Montréal à Kinshasa. En quelques minutes, elle range la plupart des bactéries en deux camps, les Gram positives et les Gram négatives. Ce n'est pas une affaire de couleur : les deux camps ont des parois construites autrement, et ils ne réagissent pas de la même façon à de nombreux traitements. Quelques bactéries échappent à ce tri, et tu verras comment on les colore. On commence par la paroi, puis la coloration, étape par étape.

Pense à la roue d'une moto-taxi de Cotonou. La chambre à air est souple : seule, gonflée à fond, elle éclaterait. C'est le pneu, rigide, qui la contient et donne sa forme à la roue. Une bactérie est construite de la même façon. Son cytoplasme est bien plus concentré que l'eau qui l'entoure dans la plupart des milieux, si bien que l'eau entre et pousse la membrane vers l'extérieur. La paroi joue le rôle du pneu. Chez les bactéries, elle est faite de peptidoglycane : de longues chaînes où alternent deux sucres, reliées entre elles par de courts ponts d'acides aminés, en une seule enveloppe qui entoure toute la cellule. C'est elle qui décide de la forme, boule ou bâtonnet. Tes cellules n'en fabriquent pas, les archées non plus. Voilà pourquoi la pénicilline, qui bloque sa construction, et le lysozyme de tes larmes, qui la découpe, visent les bactéries sans abîmer tes cellules.

Compare les deux enveloppes critère par critère. Première différence, l'épaisseur : chez les bactéries à Gram positif, le peptidoglycane s'empile en nombreuses couches, sur plusieurs dizaines de nanomètres, alors que chez les Gram négatifs il ne mesure que quelques nanomètres. Deuxième différence, ce qui l'accompagne. Chez les Gram positifs, des acides teichoïques traversent cette épaisse couche. Chez les Gram négatifs, la mince couche est prise en sandwich entre la membrane plasmique et une seconde membrane, la membrane externe, avec entre elles un compartiment liquide, le périplasme. La face extérieure de cette membrane externe est faite de lipopolysaccharide, le LPS. Sa partie lipidique, le lipide A, est une endotoxine : libérée par des bactéries qui meurent, elle déclenche fièvre et inflammation, et peut conduire au choc. Elle résiste à la chaleur de l'autoclave : une pharmacie qui prépare des solutés injectables contrôle donc l'absence d'endotoxines, et pas seulement l'absence de bactéries vivantes. Garde ces deux schémas en tête pour comprendre la coloration.

Voici le déroulement, tel que tu le verras sur une paillasse. On étale d'abord une goutte de culture en couche très fine, on la laisse sécher, puis on la fixe. Le cristal violet colore toutes les cellules, sans distinction. Le lugol, une solution d'iode, se lie ensuite au colorant et forme avec lui de grosses molécules, bien plus difficiles à déloger. Vient le moment qui fait le tri : quelques secondes d'alcool, ou d'un mélange d'alcool et d'acétone. Chez un Gram positif, l'alcool dessèche et resserre l'épaisse couche de peptidoglycane, qui garde le colorant prisonnier. Chez un Gram négatif, il dissout une partie des lipides de la membrane externe, et la mince couche de peptidoglycane ne retient plus rien : la cellule redevient incolore. La safranine, un colorant rose, donne enfin une couleur à ces cellules décolorées. Il ne reste qu'à rincer, sécher et observer à l'objectif à immersion.

La lecture est simple : violet, c'est Gram positif ; rose, c'est Gram négatif. Mais un bon compte rendu ne s'arrête pas à la couleur. Tu notes aussi la forme et le groupement. Par exemple : coques à Gram positif en amas, ce qui oriente vers des staphylocoques ; bacilles à Gram négatif isolés, ce qui oriente vers des entérobactéries, la grande famille d'Escherichia coli ; ou bacilles à Gram positif en chaînettes, qu'on rencontre chez les lactobacilles du yaourt. Le mot important est oriente. La coloration de Gram ne donne pas un nom d'espèce, elle dit dans quelle direction chercher.

Avant de lire une lame, pose-toi trois questions. Le frottis est-il fin ? Un dépôt trop épais se décolore mal : des bactéries à Gram négatif, protégées par l'épaisseur, restent violettes et passent pour des positives. L'alcool a-t-il agi le temps prévu ? Laissé trop longtemps, il finit par vider même les parois épaisses, et des Gram positifs apparaissent roses. La culture est-elle jeune ? En vieillissant, des bactéries à Gram positif abîment leur paroi et prennent des teintes mêlées, ni franchement violettes, ni franchement roses. La parade tient en deux gestes. On colore une culture d'une nuit, prélevée le matin. Et on dépose sur la même lame deux témoins connus, par exemple un staphylocoque, Gram positif, et Escherichia coli, Gram négatif. Si l'un des deux n'a pas la couleur attendue, on ne lit pas la lame : on la refait.

Le bacille de la tuberculose a une paroi chargée de lipides particuliers, les acides mycoliques, qui la rendent presque cireuse. Les colorants du Gram y pénètrent mal, et le résultat ne veut rien dire. La méthode de Ziehl-Neelsen contourne l'obstacle par la chaleur. On recouvre le frottis de fuchsine, un colorant rouge, et on chauffe doucement la lame jusqu'à ce qu'elle fume : le colorant force alors la barrière cireuse. Un bain d'alcool additionné d'acide retire ensuite le rouge de presque tout, sauf des mycobactéries, qui le gardent. Une dernière coloration au bleu de méthylène teinte le reste. À l'oculaire, les bacilles apparaissent comme de fins bâtonnets rouges sur un fond bleu : on parle de bacilles acido-alcoolo-résistants. Dans bien des centres de santé, cet examen des crachats reste courant, à côté des tests moléculaires rapides que l'OMS recommande désormais en premier. Retiens qu'aucune coloration ne convient à toutes les bactéries.

Retiens la logique, pas seulement les couleurs. La paroi des bactéries contient du peptidoglycane. Épais, il retient le complexe violet et iode malgré l'alcool : la bactérie est Gram positive et reste violette. Mince et recouvert d'une membrane externe, il laisse partir ce complexe : la bactérie est Gram négative et prend la couleur rose de la safranine. Une décoloration trop longue ou une culture trop âgée faussent tout, d'où l'intérêt des cultures jeunes et des témoins connus. Et pour les mycobactéries, que le Gram colore mal, on passe à la coloration de Ziehl-Neelsen. Dans la dernière leçon de ce module, tu vas voir ce que certaines bactéries ajoutent autour de cette paroi : capsules, flagelles, pili, et la redoutable spore.