Les tampons et l'équation de Henderson-Hasselbalch

Dans la leçon précédente, tu as vu que chaque compartiment du vivant tient son pH. Pourtant, une cellule fabrique des acides sans arrêt en travaillant. Comment son pH ne s'effondre-t-il pas ? Grâce aux tampons. Au laboratoire, c'est la même histoire : une enzyme étudiée à Kinshasa ou à Lyon ne donne des résultats fiables que si le pH du tube reste stable. Tu vas d'abord comprendre le principe, puis le chiffrer avec l'équation de Henderson-Hasselbalch sur une expérience avec et sans tampon. Tu verras ensuite comment le sang se règle, jusqu'où un tampon résiste, et tu composeras ta propre recette. Garde ta calculatrice près de toi.

Un tampon repose sur les deux formes d'un même couple, présentes en quantités voisines : un acide faible, qui garde une réserve de protons, et sa base conjuguée, prête à en saisir. Dans ta cellule, le couple phosphate joue ce rôle : H₂PO₄ moins d'un côté, HPO₄ deux moins de l'autre. Si un acide arrive, ses protons sont saisis par HPO₄ deux moins, qui devient H₂PO₄ moins. Si une base arrive et enlève des protons, H₂PO₄ moins en rend aussitôt et devient HPO₄ deux moins. Les deux formes se relaient, et le pH bouge à peine. Mais chaque relais consomme une partie de l'une des deux formes : un tampon amortit, il ne protège pas sans limite. Tu vas voir de combien, chiffres à l'appui.

Cette équation relie le pH d'un tampon à deux choses : le pKa de l'acide et le rapport entre la base et l'acide. Lis-la avec moi : le pH est égal au pKa, plus le logarithme du rapport base sur acide. Trois cas sont à connaître par cœur. Si la base et l'acide sont en quantités égales, le rapport vaut 1, son logarithme vaut zéro, et le pH est égal au pKa. Si la base est dix fois plus abondante, on ajoute une unité. Si elle est dix fois moins abondante, on retire une unité. Avec ces trois repères, tu peux déjà estimer de tête le pH de la plupart des tampons.

Fais l'expérience sur le papier. Dans 100 millilitres d'eau pure, verse 1 millilitre d'acide chlorhydrique à 1 mole par litre, soit une millimole de protons. Leur concentration devient voisine de 0,01 mole par litre : le pH tombe de 7 à 2. Recommence avec 100 millilitres de tampon phosphate qui contient 0,050 mole par litre de chaque forme, soit 5 millimoles de H₂PO₄ moins et 5 millimoles de HPO₄ deux moins. Au départ, le rapport vaut 1 et le pH est égal au pKa, 7,20. La millimole de protons est saisie par la forme basique : il reste 4 millimoles de HPO₄ deux moins, et la forme acide monte à 6 millimoles. Le pH vaut 7,20 plus le logarithme de 4 sur 6, soit environ 7,02. La même dose d'acide fait perdre cinq unités de pH à l'eau pure, et moins de deux dixièmes au tampon.

Dans le sang, le couple principal associe le dioxyde de carbone dissous, qui forme l'acide carbonique, et l'ion bicarbonate. Pour ce couple, on prend un pKa de 6,1, et on obtient la concentration de CO₂ dissous en multipliant sa pression partielle, en millimètres de mercure, par 0,03, plus précisément 0,0307. Fais le calcul à l'envers. Pour un pH de 7,4, le logarithme du rapport vaut 7,4 moins 6,1, soit 1,3, et 10 puissance 1,3 donne à peu près 20 : le sang garde environ vingt fois plus de bicarbonate que de CO₂ dissous. Ce tampon a une particularité qu'aucun tube de laboratoire ne possède : ses deux termes sont réglés de l'extérieur. La respiration ajuste le CO₂ en quelques minutes à quelques heures ; les reins ajustent le bicarbonate en quelques heures à quelques jours. On fait ici de la chimie pour comprendre, pas un diagnostic.

Reprends l'équation. Une unité au-dessus du pKa, la base est dix fois plus abondante que l'acide ; une unité au-dessous, c'est l'inverse. Au-delà, la forme minoritaire devient si rare que chaque nouvel ajout l'épuise vite, et le pH se met à bouger. On retient donc une zone utile qui va à peu près d'une unité sous le pKa à une unité au-dessus : pour le phosphate, de 6,2 à 8,2 environ. Il existe une seconde limite, la quantité. Les 100 millilitres de tampon de l'exemple contiennent 5 millimoles de HPO₄ deux moins : passé 5 millimoles d'acide fort, il ne reste plus rien pour saisir les protons, et le pH plonge comme dans l'eau pure. Le même tampon préparé à 0,10 mole par litre de chaque forme en aurait encaissé deux fois plus. Cette réserve s'appelle le pouvoir tampon : elle grandit avec la concentration du tampon.

Tu dois préparer un tampon à pH 8,0, courant dans les laboratoires de biologie moléculaire. Le Tris, une petite molécule qui porte une fonction amine, a un pKa de 8,07 à 25 degrés : il est donc bien placé. Sa forme acide, protonée, se note TrisH plus ; sa forme basique, Tris. Écris l'équation : le logarithme du rapport base sur acide vaut 8,0 moins 8,07, soit moins 0,07. Le rapport vaut 10 puissance moins 0,07, environ 0,85. Il te faut donc à peu près 0,85 mole de Tris pour 1 mole de TrisH plus : un peu plus d'acide que de base, puisque le pH visé est juste sous le pKa. Au laboratoire, on prépare le mélange d'après ce calcul, puis on ajuste au pH-mètre, à la température où le tampon servira, car le pKa du Tris bouge nettement quand la température change.

Garde d'abord l'expérience en tête : la même millimole d'acide fait plonger l'eau pure de cinq unités de pH, et le tampon phosphate de moins de deux dixièmes. Un tampon tient parce que ses deux formes se relaient. L'équation de Henderson-Hasselbalch donne son pH à partir du pKa et du rapport des deux formes, et elle sert aussi à l'envers, pour composer une recette. Un tampon travaille bien à une unité près de son pKa, tant qu'il lui reste assez de chacune de ses formes. Le sang garde environ vingt fois plus de bicarbonate que de CO₂ dissous, et le corps règle ces deux termes par la respiration et par les reins. Dans le lab, tu calculeras une recette de tampon phosphate ; la leçon suivante revient aux liaisons faibles, celles qui donnent leur forme aux molécules.